### 培养条件

在细胞培养的气相条件下，推荐使用95%空气与5%二氧化碳的混合气体，最佳培养温度为37℃。

### 传代方法

首次传代建议使用1:2的比例进行传代。在细胞培养过程中，定期更换培养液，每两天更换一次。

收到细胞后，处理方式如下：在细胞状态良好时，使用完全培养液灌满细胞瓶并封好瓶口，这是运输细胞的最佳做法。

### 细胞处理与培养

收到细胞后，使用75%酒精对细胞瓶表面进行消毒，然后将细胞转移至超净台进行严格的无菌操作。接着，将细胞瓶放置于37℃、5% CO₂培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行处理。观察细胞生长情况，并拍照记录（建议使用40x, 100x, 200x的显微镜倍数各一张）。前三天的照片将作为重要的售后依据，若不提供照片，将默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

#### a. 细胞传代

如果细胞汇合度未超过80%，请将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO₂的孵箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代培养。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙和镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟。观察显微镜下的细胞状态，若细胞大多变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶，并加入5ml培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落，随后吸出并转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，并添加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，再放入37℃、5% CO₂细胞培养箱继续培养。

#### b. 悬浮细胞传代步骤

1. 使用半换液法，将培养瓶竖直放置于培养箱中静置约1小时，轻轻地吸掉3ml培养基，再补充3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接加入约500ul FBS，传代时可直接补充5ml培养基，分为两个培养瓶进行培养，通常进行3次传代后可进行离心传代以去除死细胞。
2. 如需分瓶可使用离心换液法，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，补充1-2ml培养液后重悬混匀，再按1:2的比例分配到新的T25瓶中，添加6-8ml配制的新的完全培养基以保障细胞的生长活力。后续传代根据实际情况可按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存

1. 在细胞覆盖培养瓶的面积达到80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，并使用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml 0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，并轻轻吹打使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中。如后期需转入液氮罐，建议在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后重悬于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，并放于37℃、5% CO₂细胞培养箱中进行培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基，继续培养。

### 注意事项

部分细胞在运输过程中可能容易脱落，这是正常现象。如果脱落细胞较多，可将培养瓶中所有培养液收集至离心管，进行1000rpm离心5分钟，以收集上清作过渡培养（后期可用于对比培养）。沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，并消化1-2分钟。接着加入5ml完全培养基终止反应，离心后弃去上清，再加入1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO₂细胞培养箱继续培养。

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