实验原理：本实验旨在通过提取动物机体的各种组织，并利用特定的酶（如胰蛋白酶）和螯合剂（如EDTA）或机械方法，将其处理为单细胞悬液。将处理后的细胞置于适宜的培养基中进行培养，使其存活、增长和繁殖，这一过程被称为原代培养。当细胞在培养瓶中形成致密的单层后，细胞数量即达到了饱和状态。为了继续促进细胞生长并扩大细胞数量，必须实施传代培养。这种传代培养不仅是保留细胞株的一种手段，也是进行各种实验时必不可少的步骤。悬浮型细胞可以直接分瓶，而贴壁细胞则需经过消化后才能进行分瓶操作。

实验仪器：用于本实验的仪器包括培养箱（调整至37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机以及水浴箱（37℃）。

实验试剂：所需试剂有1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hanks液、碘酒及75%酒精。

实验步骤

一、原代细胞培养步骤

1. 准备：在净化台上准备好所有消毒过的培养用品，并用紫外线消毒20分钟。工作之前洗手并用75%酒精擦拭手部至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，并安装吸管帽。

3. 处理组织：将组织块置于烧杯中，用Hanks液清洗2-3次以去除血污；若怀疑组织可能被污染，可先用含青链霉素的混合液进行处理30-60分钟。

4. 剪切：用眼科剪将组织剪成2-3毫米的小块，以方便消化。加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液，并转入三角烧瓶中，结扎瓶口或以胶塞封住。

5. 消化：可在恒温水浴或37℃的培养箱中进行消化，每隔20分钟摇动一次，使用电磁搅拌器进行消化效果更佳。消化时间视组织块的大小和硬度而定。

6. 分离：当消化液出现混浊时，用吸管抽取少量消化液观察，如果组织已经分散为细胞团或单个细胞，立即停止消化，然后通过合适的不锈钢筛过滤掉未消化的组织块。低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清液，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：使用计数板进行细胞计数，如细胞悬液的细胞密度过大，需补加培养液调整后再分装入培养瓶中。大多数细胞的pH要求在7.2-7.4范围，若培养液呈微红色，若颜色偏黄则需用NaHCO3进行调整。

8. 培养：将培养瓶置于37℃的培养箱中，若使用CO2培养箱，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽封住，纱布塞需每次换液时更换为新塞，以防霉菌生长。

二、原代组织块培养法

1. 剪切：将组织小块放入小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液清洗数次以去除表面血污，使用眼科剪将组织小块剪割至1mm。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，确保组织小块相互间隔为0.5cm，每个25ml的培养瓶底部可放置20-30块组织。

3. 轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，注意翻动时不要让组织小块移位，封好瓶口，置于37℃的培养箱中培养约2小时（切勿超过4小时），使小块微干。

4. 培养：从培养箱中取出瓶子，打开瓶塞，以45°斜持瓶口缓慢注入培养液，覆盖贴附于瓶底的组织小块。置于培养箱中静置培养，当细胞从组织块释放增多后，再补加培养液。

三、贴壁细胞传代操作步骤

1. 吸出培养瓶内的旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA的混合液，覆盖瓶底。

3. 将瓶子置于培养箱中2-5分钟，观察细胞质回缩和细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，加入数毫升Hanks液，轻轻转动培养瓶冲洗，注意动作要轻，以免损失已松动的细胞。

5. 用吸管吸取营养液，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使其形成细胞悬液。

6. 经过计数后，将细胞悬液分装入多个培养瓶中，放入培养箱中进行培养。

四、悬浮型细胞传代

1. 吸出细胞培养液，倒入离心管中，离心1000rpm 5分钟。

2. 吸去上清液，加入适量的新鲜培养基，混合均匀后，按照稀释比例转移至新的培养瓶中，并在正常培养条件下进行培养。

注意事项

1. 操作前必须洗手并使用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭进入超净台的手部，试剂瓶口也要擦拭。

2. 在酒精灯旁操作时将耐热物品经常火焰消毒，金属器械需控制时间，以免退火并需冷却后方可触碰组织。吸取过培养液的器具不得再暴露于火焰中，以防烧焦。

3. 操作时动作需准确敏捷，但不应过快，以避免空气流动增加污染风险。

4. 不得用手触碰已消毒器皿的工作部分，工作台面的布局要合理。

5. 瓶口打开后应保持在45°斜位。

6. 吸取溶液的吸管等器具不得混用。

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