掌握以下几种方法，可以轻松辨别细胞状态，尤其是在显微镜下观察活细胞时，活细胞通常具有透亮的外观、完整的细胞膜，以及清晰可见的细胞核和细胞质内的细胞器。对于贴壁细胞而言，活细胞能够牢固地贴附在培养皿或培养瓶上。相对而言，死细胞则呈现暗淡无光、细胞膜可能出现破裂，且对于贴壁细胞无法有效附着。悬浮细胞的死细胞可能会表现出膜损伤和内容物外泄的现象。

细胞的生长形态也是判断其状态的重要依据。不同类型的细胞呈现特定的生长形态，例如，成纤维型细胞通常呈细长形状并附着在基质上生长，而上皮型细胞则呈多边形。观察细胞是否保持其特有的生长形态，有助于判断其是否存活。

**台盼蓝染色法**是一种常用的细胞活性检测方法。其原理基于台盼蓝是一种活细胞无法吸收的染料，仅对死细胞有效。活细胞因细胞膜的完整性而排斥台盼蓝，不会被染色；死细胞由于细胞膜通透性增加，便可被台盼蓝染成蓝色。操作过程为：将细胞与台盼蓝溶液混合后，通过显微镜观察染色情况，染色时间不宜过长，通常在3分钟内观察结果，以避免活细胞因长时间接触染料而被误染。其他染色方法如伊红-美蓝染色、中性红染色等，也常用于检测细胞活性，但应根据实验需求和细胞类型选择合适的方法。

贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后观察细胞消化情况。如果大部分细胞已变圆并脱落，迅速将培养瓶拿回操作台，轻拍几下，随后加5ml以上的完全培养基终止消化。

3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。

4. 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（例如两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入到37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

悬浮细胞传代步骤

1. 半换液法：将培养瓶竖着放置于培养箱静置约1小时，轻轻吸掉约3ml培养基后，补给3ml完全培养基，如果培养基变色较慢，可以直接加入约500μl FBS。在传代时，可以直接补给5ml培养基至两个培养瓶，经过3次半换液后，可以进行一次离心传代，去除死细胞。

2. 离心换液法：如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml培养液重悬，然后按1:2比例分入新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新完全培养基，以保持细胞的生长活力，后续的传代可根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶的80%面积时，弃去培养液，并用PBS清洗一次细胞。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml于培养瓶中，翻转并在显微镜下观察，待细胞回缩并变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，并轻轻吹打细胞使其脱落，转移悬液至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后放入冻存管中。

4. 将冻存的细胞直接置入-80℃冰箱中。如需后期转入液氮罐，请先在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转移。

细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重新悬浮，并接种至T25培养瓶，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

4. 第二天，换用新鲜的完全培养基继续培养。

在细胞培养和处理过程中，采用正确的步骤和方法将有助于确保细胞的健康和活力。这不仅可以提高实验结果的可靠性，还能够为进一步的研究奠定基础。不妨参考俄罗斯专享会294提供的专业资源，以满足更多的实验需求。